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    液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫學檢驗實踐中的專家共識

    2019年02月03日 熱度:992 ℃

    作者:中華醫學會檢驗醫學分會

    國家衛生健康委員會臨床檢

    液體活檢(liquid biopsy)在腫瘤臨床診斷治療領域的應用日益廣泛,是實現對腫瘤"個體化精準醫療"的重要手段。為科學規范液體活檢技術在臨床檢驗中的應用,中華醫學會檢驗醫學分會、國家衛生健康委員會臨床檢驗中心共同制定了《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫學檢驗實踐中的專家共識》,并廣泛征求了臨床腫瘤專家和醫學檢驗專家的意見。

    本應用建議最后經中華醫學會檢驗醫學分會和國家衛生健康委員會臨床檢驗中心組織專家進行討論修改后,由中華醫學會檢驗醫學分會、國家衛生健康委員會臨床檢驗中心共同發布。鑒于液體活檢技術發展迅速,本應用建議將適時修訂,以適應醫學發展和滿足臨床應用的需求。

    液體活檢是指利用人體體液作為標本來源檢測獲取腫瘤相關信息的技術[1,2]。相比于傳統侵入式組織活檢,液體活檢具有依從性佳、標本易獲取、特異性好等優勢;更重要的是,其能有效克服腫瘤異質性,可有效實現精準的腫瘤輔助診斷、實時監測、療效評價及預后判斷[2]。因此,液體活檢有望成為癌癥早期輔助診斷、伴隨診斷、治療監測及預后評估的理想技術。液體活檢主要包括循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)和外泌體等檢測,其中ctDNA與CTC是目前最受關注的兩類液體活檢靶標[3,4]。ctDNA是指人體血液循環中攜帶有腫瘤特異性基因突變、缺失、插入、重排、拷貝數變異及甲基化等信息的DNA片段,其主要來源于壞死或凋亡的腫瘤細胞、循環腫瘤細胞或者腫瘤細胞分泌的外泌體[5]。CTC是指自發或被動地從實體腫瘤病灶脫落進入到血液循環的腫瘤細胞。作為腫瘤轉移/復發的"種子",CTC攜帶有大量與腫瘤發生、發展、轉移以及耐藥相關的信息[6,7]。

    在臨床實踐過程中應該謹慎評估液體活檢的分析有效性、臨床有效性以及臨床實用性[8]。本專家共識圍繞CTC和ctDNA兩種靶標,綜合近年來發表的液體活檢領域重要研究成果、結合我國腫瘤液體活檢的臨床實踐需求,就相關的臨床常用檢測技術的實施和質量管理提供常規指導原則。本共識主要分為兩大部分:(1)液體活檢的臨床應用,(2)液體活檢的醫學檢驗實踐。

    第一部分 液體活檢的臨床應用

    一、液體活檢技術的選擇

    1

    ctDNA檢測技術的選擇

    目前,實驗室常用的ctDNA檢測技術包括擴增受阻突變體系(amplification refractorymutation system,ARMS)、二代測序(next-generation sequencing,NGS)、數字PCR(digital PCR,dPCR)和核酸質譜檢測等。ARMS方法是目前獲得中國食品藥品監督管理局(China Food and DrugAdministration,CFDA)批準可用于臨床ctDNA檢測的方法,在臨床實踐中應用相對普及。由于NGS方法在技術與成本方面存在瓶頸,使得ARMS在檢測諸如EGFR等已知突變中具有明顯優勢。針對未知突變的發掘,NGS方法則具有其他方法無可比擬的技術優勢。包括Nature Medicine[8]、Lancet Oncology[9]及New England Journal of Medicine[10]在內諸多頂級期刊所報道的多項臨床試驗結果證實NGS在耐藥監測中具有重要的臨床價值:通過NGS監測可有效發掘耐藥新突變,及時調整干預措施,切實提高靶向治療療效。dPCR和基于質譜的核酸檢測方法盡管可應用于已知突變ctDNA的檢測,但僅限于實驗室自建,尚缺乏高等級循證醫學證據的支持,目前仍難以進入臨床實踐?;谏鲜鲅芯拷Y果與臨床實際,專家組認為檢測已知、單個靶向治療敏感或耐藥型突變時,建議使用ARMS方法;檢測已知、多個平行臨床治療靶點或發現未知基因、探索臨床價值與相關機制時建議使用NGS方法;dPCR具有驗證NGS檢測結果的潛能,但在應用前應當嚴格評估其檢測性能與臨床意義。

    2

    CTC檢測技術

    CellSearch平臺是目前唯一被CFDA批準用于定性檢測循環血中上皮來源腫瘤細胞的技術。其在判斷轉移性結直腸癌、乳腺癌及前列腺癌患者預后的臨床應用價值具有高等級循證醫學證據支持。但此檢測技術存在漏檢率較高、富集后CTC活性差難以進行后續基因組分析等缺點。其他檢測技術如免疫磁珠法和微孔過濾法等,盡管在多方面展現出優良的CTC檢測性能,但目前仍缺乏足夠的循證醫學證據支持其臨床應用。故臨床常規檢測CTC,建議各實驗室選擇適合自身條件的檢測技術,在充分評估其檢測性能后,應用于日常工作

    臨床實踐中選擇液體活檢技術:

    共識1 檢測患者ctDNA是否含有已知的、單個靶向治療敏感或耐藥型突變時,建議使用ARMS方法。

    共識2 檢測患者ctDNA已知的部分或全部臨床藥物治療靶點譜或耐藥指示靶點譜,或發現患者基因未知突變、探索臨床價值與相關機制時建議使用NGS方法。

    共識3 臨床常規檢測CTC,建議各實驗室選擇適合自身條件的檢測技術,在充分評估其檢測性能后,應用于日常工作。

    二、液體活檢的應用范圍

    (一)腫瘤早期輔助診斷

    1

    ctDNA早期輔助診斷價值:

    隨著檢測技術敏感度提高,目前ctDNA已可在早期肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌患者循環中被檢出[11,12,13],提示ctDNA對于這幾種惡性腫瘤具有早期輔助診斷潛能。必須注意的是,特定突變例如P53突變可在健康人群中被檢出[14];此外,可用于早期診斷輔助ctDNA分子譜在不同癌種變異度較大且都未經過大樣本臨床驗證,實際效能仍不明確[15]。因此,需要探索更加特異的ctDNA分子譜并設計大規模前瞻性臨床試驗證實其價值,目前距離真正臨床應用還有較大距離。

    2

    CTC早期輔助診斷價值:

    既往CTC研究多集中于其轉移/復發的預測價值[16,17,18]。近年來研究證實CTC的釋放是一種腫瘤早期事件,提示CTC對腫瘤早期輔助診斷具有重要價值[19,20,21]。然而非腫瘤患者例如炎癥性腸炎或慢性肝炎患者體中可檢出低水平的假陽性結果[21,22]。由此可見,目前CTC并非一種完美的早期輔助診斷靶標。此外,目前也缺乏CTC展現出優于影像學診斷的臨床證據。綜上,現階段CTC仍不適合單獨用于腫瘤早期輔助診斷,需要更多的循證醫學證據證明其價值。

    (二)指導臨床用藥

    1

    ctDNA的臨床用藥指導作用:

    腫瘤精準治療可通過檢測腫瘤相應的基因信息,選擇合適的靶向藥物用于后續治療。故ctDNA檢測可提供十分重要的參考信息。截止2018年3月,主要腫瘤相關基因改變的靶向藥物選擇如表1所示。?

    表1?腫瘤相關基因改變與靶向藥物選擇

    需要注意的是,目前ctDNA檢測僅在非小細胞肺癌中被美國食品藥品監督管理局(Food and DrugAdministration,FDA)批準用于指導EGFR酪氨酸激酶抑制劑選擇并寫入美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南。對于其他藥物選擇,目前仍處于探索階段,尤其在檢測T790M時,對陰性結果應盡可能通過后續的組織檢測進行確認。因此,未來還需要更多前瞻性循證醫學證據來支撐ctDNA的指導作用。

    2

    CTC的臨床用藥指導作用:

    CTC作為完整細胞,具有多種來源的腫瘤信息,包括蛋白、DNA突變、編碼及非編碼RNA信息等[18]。針對CTC的體外培養與藥敏實驗被證明可用于篩選靶向藥物,具有巨大的臨床轉化潛能[4,34]。但是,現有臨床CTC檢測體系在活性CTC分離問題上仍存在關鍵性的技術瓶頸,尚不能滿足提供多元化信息以指導靶向用藥的臨床需求;其他CTC分離檢測技術或指導價值不明確或短時間內難以轉化。故盡管CTC檢測對于指導臨床實行精準治療具有重要的潛在價值,但在更先進的技術和更可靠的臨床證據出現之前,不鼓勵在實際臨床工作中用其指導靶向化療。

    (三)靶向藥物伴隨診斷

    1

    ctDNA在靶向藥物伴隨診斷中的應用:

    靶向藥物使用過程中實行伴隨診斷有助于確保藥物安全性與有效性,是執行"精準醫療"理念的核心步驟之一。因此,伴隨診斷在臨床腫瘤綜合管理中的價值愈發顯著。截至2018年4月,已有多種靶向藥物伴隨診斷系統被FDA批準用于實際臨床工作,常見適用伴隨診斷的藥物及其靶點如表2所示。?

    表2?常見適用伴隨診斷的藥物及其靶點

    ctDNA檢測相對于常規組織活檢具有非侵入性、患者依從性好、異質性低、可反復取材等優勢,其在靶向藥物伴隨診斷中具有很大的優勢[1]。目前,ctDNA檢測應用于非小細胞肺癌EGFR靶向治療伴隨診斷已被NCCN寫入指南。未來伴隨著更先進技術以及更多臨床證據的出現,將會有越來越多ctDNA檢測用于靶向藥物伴隨診斷。

    2

    CTC在靶向藥物伴隨診斷中的應用:

    目前并無循證醫學證據提示CTC可應用于伴隨診斷,但小規模研究顯示CTC分子譜分析對于靶向藥物伴隨診斷具有積極意義[35]。未來需要更多的高級別臨床證據充分探索CTC在伴隨診斷中的作用。

    (四)實時療效監測

    1

    ctDNA實時療效監測價值:

    相比傳統的影像學與血清蛋白類腫瘤標志物,ctDNA在反映療效方面具有更好的特異性與敏感度,理論上可準確反映機體腫瘤負荷的細微變化[1]。已有小規模隊列研究證實連續監測腫瘤患者體內ctDNA突變豐度的變化可反映治療后個體腫瘤負荷變化,及時提示臨床更換有效的治療策略[6,18,36]。但是,目前ctDNA檢測存在重復性不佳、不同實驗室間檢測結果一致性較差、檢測結果在不同實驗室間互換性低、缺乏量化DNA負荷的最佳單位等缺陷,嚴重制約了ctDNA在臨床實踐中的應用價值[37]。因此,檢測ctDNA反映實時腫瘤療效仍處于臨床前階段,亟待技術進步與大規模RCT研究來充分驗證其價值。

    2

    CTC實時療效監測價值:

    CTC在反映療效中的優勢在于其信息的多維性,除數量變化外還可提供豐富的參數供臨床分析,從而系統地描繪出腫瘤演進分子圖譜。研究顯示CTC動態變化與療效顯著相關,且較影像學與蛋白類標志物展現出更好的敏感度與特異性[7,38]。但是,在現有檢測技術條件下其療效評估效能略遜于ctDNA,且CTC檢測存在諸如重復性較差、循環空間異質性、缺乏理想分離方案等缺陷,限制其大規模臨床應用[17]。因此,CTC暫時不是一種可直接應用于臨床療效監測的理想靶標,其轉化有待更好的檢測技術出現與更多的臨床證據證實。

    (五)腫瘤進展與不良預后早期預警

    1

    ctDNA早期預警作用:

    ctDNA檢測對于包括肺癌、結直腸癌、乳腺癌在內的多種實體瘤進展具有重要預警價值,其豐度改變可早于影像學發現復發/轉移灶[1]。這意味著可通過ctDNA檢測篩選出復發/進展高風險的患者,為其在臨床進展前創造干預治療的機會。此外,ctDNA豐度也與腫瘤患者無病生存期(disease free survival,DFS)以及總體生存期(overall survival,OS)密切相關,特定亞克隆ctDNA的檢出對預測患者預后具有重要預測價值[37]。但是,目前大部分報道為小樣本研究,缺乏大樣本、多中心、前瞻性設計的臨床試驗;此外亦缺乏高級別循證醫學證據支持患者能夠從ctDNA指導的臨床決策中獲得比常規腫瘤管理更多的臨床收益[8,36,37]。因此,臨床轉化ctDNA用于腫瘤進展與不良預后早期預警仍需要更多的高級別循證醫學證據。

    2

    CTC早期預警作用:

    CTC檢測被FDA審批可用于預警轉移性結直腸癌、轉移性乳腺癌、轉移性前列腺癌患者的疾病進展/不良預后[18]。對其他實體惡性腫瘤例如惡性黑色素瘤、肝癌、胃癌等,CTC也展現出良好的預測價值[39]。但是,目前仍缺乏足夠的循證醫學證據支持CTC檢測在其他惡性腫瘤中的早期預警價值。未來需要更多設計良好的臨床試驗來證實CTC在腫瘤進展/不良預后早期預警中的價值。

    (六)耐藥機制探索

    1

    ctDNA在耐藥機制探索中的應用:

    ctDNA在反映靶向治療獲得性耐藥中具有天然優勢,通過高靈敏度方法追蹤ctDNA變異情況,進而繪制腫瘤獲得性耐藥基因變化演進圖譜有助于揭示耐藥新機制,發現新的治療靶點[40,41];在發現特定亞克隆與耐藥關聯性的基礎上,深入分析耐藥克隆亞群并探究其分子機制,可為逆轉獲得性耐藥提供充分的轉化依據[42]。因此,ctDNA是一種非常理想的耐藥機制探索切入點。需要注意的是,目前此領域的研究正處于起步階段,還不足以引入臨床實踐。

    2

    CTC在耐藥機制探索中的應用:

    CTC本身作為腫瘤轉移/復發的"種子",其展現出的干細胞樣特征、上皮-間充質轉化特征、以及極強的耐受能力都提示其是腫瘤演進過程中耐受治療的生力軍與基石[43]。已有研究證實通過分析CTC基因譜可揭示化療耐受的具體機制,并藉此逆轉耐藥[44]。但是目前此領域研究仍局限于極小部分的患者,對腫瘤的異質性與復雜性考慮并不充分,廣泛性仍有待驗證。

    液體活檢應用范圍:

    共識4 推薦液體活檢應用于無法獲取組織標本的患者。

    共識5 ctDNA檢測可應用于指導肺癌EGFR靶向藥物選擇與伴隨診斷,ctDNA可能用于療效監測、早期輔助診斷及腫瘤進展與不良預后早期預警,但現階段僅限于科研探索。

    共識6 CTC檢測可用于轉移性結直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進展/不良預后早期預警,但其指導用藥、療效監測、靶向藥物伴隨診斷及早期輔助診斷作用現階段僅限于科研探索。

    第二部分 液態活檢的醫學檢驗實踐

    一、實驗室的總體要求

    1

    實驗室環境要求

    液體活檢實驗室對于場地的空間、環境(溫度、濕度、電壓、水質)和分區有嚴格要求。建議根據開展項目預留出儀器和輔助設備的裝載空間,以及操作和數據處理的工作空間。儀器不可直接安裝于空調下方和陽光直射處,四周應留出適當空間便于日常操作、定期維護保養和檢修。實驗室溫濕度等環境因素應嚴格參照廠商建議的最適工作條件設定,以保證儀器正常運行。為保證儀器檢測性能的穩定和可靠,建議配備穩壓的連續不間斷電源。實驗室應根據實際用途,制定適宜的水質標準,定期質檢。

    涉及核酸檢測的實驗室,各工作區空氣及人員流向需嚴格參照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》配置,工作中有嚴格避免污染的措施:(1)前處理和建庫時,建議避免低濃度標本與高濃度標本分開,如胸腔積液、腹腔積液標本與血液、腦脊液和尿液標本分開,避免標本間的交叉污染;(2)擴增前后的操作步驟分開,避免擴增產物污染非擴增區;(3)影響檢測結果的特異處理步驟應獨立分區。樣品制備區及其他分區需要時應配備通風柜或超凈臺,實驗室應配置固定和移動紫外線燈,波長為254 nm,照射時離實驗臺的高度一般為60~90 cm。

    涉及細胞培養時,操作人員必須更換、穿戴好工作服、鞋、帽和口罩方能進行實驗。有關細胞培養的操作均在超凈臺上完成,嚴格按無菌程序操作,所有進入細胞培養室的人員都必須遵守實驗室有關的規章制度。

    2

    實驗室安全要求

    依據《中華人民共和國衛生行業標準-臨床實驗室安全準則》、《中華人民共和國國家標準實驗室生物安全通用要求》和《危險化學品安全管理條例》等相關文件,實驗室應制定適當的安全防護措施。實驗室需安裝安全沖淋設施和洗眼器。實驗過程中使用的化學危險品應貼有成分標簽,按說明要求分類儲存、雙人雙鎖。依據《醫療衛生機構醫療廢棄物管理辦法》,結合實際情況,對實驗過程中產生的固體、液體危險廢棄物的收集、存放和處理原則。建議實驗室責任人定期組織實施安全評估。

    3

    人員要求和資質

    實驗室管理者應監督液體活檢項目的順利實施和開展,為臨床提供精準的個體化醫療服務,并確保實驗室設備設施的完善、分區環境和生物安全符合相關法規和條例,同時指導實驗室人員的規范化流程培訓和教育。

    建議開展液體活檢項目的實驗室根據需求配備具有臨床檢驗、臨床腫瘤學、遺傳學、分子生物學、及生物信息分析學科背景的多類跨學科的人員。實驗操作人員需熟練掌握分子生物學理論與技術、經技術相關的理論和操作實踐培訓,通過技能考核,獲得上崗資質后才能正式上崗,在崗期間仍需定期培訓和考核。特殊技術人員(如CTC形態學觀察人員等)在崗期間除定期個人培訓和考核,還需完成人員間比對考核。初學人員建議在有經驗人員的指導下完成操作。生物信息分析人員應兼具生物信息學、分子生物學和(或)臨床醫學專業背景。報告簽發需由獲得中級及以上職稱,具備分子生物學、遺傳學和臨床醫學等多種專業背景,從事腫瘤液體活檢相關工作2年及以上,經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人(高級職稱或醫學博士學位)執行。

    4

    規范化文件

    1.實驗室必須根據實驗室的質量管理體系與法規要求撰寫規范化文件。實驗室規范化文件如表3所示。

    表3?實驗室規范文件列表

    液體活檢實驗室建立要求:

    共識7 臨床液體活檢實驗室必須遵循相關法規,有嚴格避免污染的措施并且定期核查評估。

    共識8 建議開展液體活檢項目的實驗室根據需求配備多類跨學科人員。

    共識9 報告的審核和發布須由從事液體活檢相關工作2年及以上、經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人(高級職稱或醫學博士學位)執行。

    2.液體活檢實驗方法的執行:實驗室主任需要確保液體活檢實驗方法在開展前完成檢測性能確立與臨床應用評估、建立完善的質量控制體系、編寫從標本采集到結果解釋全過程的規范化操作規程并且簽字許可新的液體活檢實驗方法認證報告以及執行。

    二、體液標本選擇、采集和預處理

    1

    體液標本選擇一般規律

    在臨床實踐過程中,應綜合考慮到患者病灶累及部位、轉移情況的復雜性、不同體液標本的特征,優先選擇液體活檢靶標最易檢出部位標本(例如廣泛腹腔/盆腔轉移患者可優選腹水;中樞轉移性腫瘤可優選腦脊液);針對難以判斷的患者,建議聯合多種體液標本的檢測結果,為臨床勾勒腫瘤演化的全貌,提供多維的腫瘤患者診療的圖譜。體液標本選擇一般規律如表4所示:

    表4?體液標本選擇一般規律

    2

    標本的采集和預處理

    體液中存在較強的背景干擾,加之液體活檢的信息源極其微量,易在分析過程中出現偏差,因此液體活檢對分析全過程的要求相對較高,尤其在標本預處理步驟需避免背景細胞或核酸ctDNA和CTC的稀釋作用,同時進一步防止對CTC的破壞和對ctDNA片段化以及降解,導致最終假陰性結果。

    1.體液ctDNA:

    臨床實驗室能實現多種不同體液標本內ctDNA的檢測,本應用建議僅概述常見體液標本處理的基本原則,對于其他體液標本的處理建議參考權威文獻或抽提試劑盒的說明。

    (1)血漿:目前研究表明最佳的標本類型為血漿,且最好采用含細胞穩定劑的抗凝管或者EDTA抗凝管采集血液。常規采集流程如下:肘部采集靜脈血10 ml(采血量視具體情況而定,建議不少于10 ml,避免因標本量不足導致假陰性結果),避免凝血、溶血及空腹狀態。若選擇EDTA-K2抗凝采血管,采血后輕柔顛倒8~10次,采集完畢即刻送至檢測實驗室,建議冰浴送檢,防止白細胞裂解。建議2 h內進行兩步離心完成血漿分離,分離后的血漿可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提;若選擇Streck采血管(特殊抗凝劑和保護劑),采血后輕柔顛倒8~10次,采集完畢無需即刻送至檢測實驗室(可室溫保存3~5 d),常溫轉運保存即可。建議在7 d內進行兩步離心完成血漿分離,分離后的血漿可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提。兩步離心法:在低溫(4 ℃)條件下,先以1 900×g轉速將標本離心10 min,吸取上清,再以16 000×g轉速離心10 min,最終獲得無細胞的血漿標本。

    (2)胸腔積液、腹腔積液:臨床醫師通過胸膜腔或腹腔穿刺術,采集胸腔積液或腹腔積液20 ml置于預添加EDTA抗凝劑的無菌容器中(采集量視具體情況而定),采集完畢應即刻送至檢測實驗室,常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟),分離后的上清可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提。

    (3)尿液:留取隨機中段尿20 ml置于無菌容器(采集量視具體情況而定),采集完畢應即刻送至檢測實驗室,常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟),分離后的上清可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提。

    (4)腦脊液:臨床醫生通過腰椎穿刺術,采集腦脊液2~5 ml置于無菌容器(采集量視具體情況而定),采集完畢應即刻送至檢測實驗室,常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟),分離后的上清可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提。

    (5)唾液:患者在標本采集前1 h內應禁食、禁飲、禁煙以及禁止口腔清理程序。采集早晨9~10點的唾液標本置于無菌容器,采集完畢應即刻送至檢測實驗室,常溫保存。建議2 h內完成低溫2 600×g離心15 min并分離上清,分離后的上清可直接進行抽提或保存于-80 ℃冰箱直至抽提。

    2.外周血CTC:

    肘部采集靜脈血10 ml(采血量視具體情況而定,建議不少于10 ml,避免因標本量不足導致假陰性結果),避免凝血或溶血。采血完畢應即刻送至檢測實驗室,常溫保存。若選擇EDTA-K2抗凝采血管,建議24 h內完成檢測;若選擇專用細胞保存采血管,建議72 h內完成檢測。

    三、液體活檢技術的優化和驗證

    在正式應用于臨床前,應對檢測技術或實施流程逐步優化,并完成相關性能驗證或確認。各實驗室在進行性能驗證時,可結合自身特點與檢測項目需求,在本章節設定框架下制定合適的性能驗證流程。若優化實施要素,建議對檢測技術或實施流程進行再驗證或確認,以保證優化后的性能符合檢驗和臨床要求。再驗證或確認的程度和范圍視優化的要素和程度而定。驗證或確認必須貫穿整個實驗流程。

    體液標本選擇、采集和預處理:

    共識10 體液標本選擇時應綜合考慮腫瘤來源、腫瘤部位、播散途徑、以及不同體液標本的特征,綜合考慮以期提高檢驗效率。

    共識11 標本預處理應遵循快速、穩定的原則,針對不同標本采用不同方案進行處理,盡可能保證待測物質的穩定性和濃度,確保檢測質量。

    1

    基于PCR方法(包括ARMS和dPCR)ctDNA檢測體系的性能驗證

    分析性能驗證項目應包括特異性、敏感度、測定下限、重復性、準確性、抗干擾能力六項。驗證具體內容應遵循CLSI相關文件指示,具體參考如表5所示。

    表5?ARMS定性檢測方法性能驗證參考文件

    2

    基于NGS方法ctDNA檢測體系的性能確認

    NGS方法性能確認須包含陽性預期值(Positive Predictive Value, PPV)、陽性百分比一致性、重復性、可報告范圍/參考范圍、最低檢出限、抗干擾性能、臨床有效性、及生信分析流程確認。確認具體內容應遵循CAP相關共識文獻指示,具體參考如表6所示。

    表6?NGS檢測方法性能驗證參考文獻

    對已完成性能確認的檢測體系進行改進或改動時,僅需依據體系改變部分作出相應驗證即可,無需重新進行完整系統驗證。

    3

    CTC檢測體系的性能驗證

    CTC檢測體系應依據相應EP文件對其精密度、正確度、可報告范圍、參考范圍進行性能驗證,具體參考如表7所示。

    表7?CTC檢測體系性能驗證參考文件

    液體活檢技術優化和驗證:

    共識12 商品化ARMS方法的檢測體系應當遵循相關EP文件驗證其敏感度、特異性、測定下限、重復性、準確性、以及抗干擾能力。

    共識13 基于NGS方法檢測體系須行陽性預期值、陽性百分比一致性、重復性、可報告范圍/參考范圍、最低檢出限、抗干擾性能、臨床有效性、及生信分析流程確認;如對已完成性能確認的檢測體系進行改進,僅需依據體系改變部分作出相應驗證即可,無需重新進行系統驗證。

    共識14 CTC檢測體系應當遵循相關EP文件驗證其精密度、準確度、可報告范圍、參考區間;如基于其他方法的CTC檢測體系則須在前述基礎上再行檢出限、干擾及攜帶污染驗證。

    四、質量管理

    實驗室質量管理體系分為質量保證和質量控制,需貫穿液體活檢的整個實施流程,即從分析前、分析中到分析后。完善的質量管理和控制用于確保檢測系統穩定性和結果可靠性,有效避免誤差,為臨床腫瘤診療提供更為準確的證據。

    1

    質控品的選擇

    質控品選擇在質量管理中具有關鍵性作用。應按照定性或定量的實驗目的選擇合適的質控品,以期達到理想的質量管理質量。質控品選擇標準如表8所示。

    表8?液體活檢質控品選擇標準

    2

    分析前質量管理

    3

    分析中質量管理

    抽提模板質控:凡下游涉及PCR或測序等方法,建議采用多種方法對模板核酸的質量進行評估,包括純度、濃度和完整性,以確保滿足檢測平臺的最低要求。

    1.室內質控:

    為監測分析過程中的每個步驟,要求質控品與標本的操作步驟基本相一致。建議優選商品化的質控品,若缺乏商品化產品,實驗室可嘗試自建。質控品的選擇和構建首先需注意與臨床患者標本的模擬度,同時保證組份穩定且均一,數量充足,便于長時間分析:(1)質控品配制:建議由經驗豐富的專業人員在專門區域進行構建、配制和分裝,切勿在臨床標本操作區域。自建質控品要求采用高靈敏的檢測方法進行評價;(2)質控要求:對于定性檢測項目,建議運行弱陽性、陰性質控品以及空白對照;對于定量檢測項目,建議運行定值、陰性質控品以及空白對照??紤]到每個檢測平臺的實際成本和臨床可操作性,實驗室可自行規定質控頻率和質控覆蓋位點;(3)質控規則:無論是商品化或自建質控品,實驗室需建立質控的可接受標準。定量檢測項目建議使用質控圖和設定的質控規則。

    2.質間質評:

    (1)室間質量評價(extemal quality assessment, EQA):通過參加國內外相關的EQA評價實驗室檢測能力,分析和總結能力比對的結果,關注評價結果的趨勢或改變;(2)其他評價方式:對于無室間質量評價計劃的檢測項目,建議與外部實驗室相同或相近的方法比對。

    3.NGS檢測平臺的重要參數:

    (1)文庫質量:構建的文庫在上機測序前需進行質量分析,應設定每個檢測項目的文庫質量要求,明確接受或拒絕的標準;(2)測序芯片:測序時根據檢測標本量和質量要求選擇合適的芯片,以保證測序質量和靶區覆蓋深度;(3)生物信息分析質量指標:單堿基質量、堿基質量中位數、重復reads百分比、包含接頭序列的reads數量、回貼reads百分比、目標區域reads百分比、目標區域的平均深度、目標區域測序均一度。

    4

    分析后質量管理

    分析后質量管理涉及多方面因素,需聯合生物信息學、分子生物學、遺傳學和臨床醫學專業背景的多人合作完成報告簽發和臨床解釋。

    液體活檢質量管理:

    共識15質量管理體系構建應嚴格參照CNAS-CL36:2012文件的要求設定相應質量控制程序并驗證,以達到預期的結果質量。

    共識16 質控品應按實際需求綜合考量,選擇最合適的質控品。

    共識17 質控管理實施應貫穿檢測整個過程(分析前、分析中、分析后)。

    五、數據分析與檢測報告注釋

    1

    液體活檢報告注釋

    依據檢測靶標和技術的不同,液體活檢的報告內容也有所差異,但原則上檢測報告一般應體現以下內容:(1)檢測名稱,如xx腫瘤xx基因變異檢測報告;xx腫瘤CTC檢測報告等;(2)患者基本信息:姓名、性別、年齡、住院號、送檢科室及醫生等;(3)標本基本信息:標本類型(血漿、胸腹水、腦脊液、尿液等)、標本性狀(是否存在凝塊、溶血、脂血等)、采樣時間、收樣時間、送檢日期和報告日期;(4)病理診斷信息:腫瘤組織類型、TNM分期等;(5)檢測方法和平臺以及其重要的參數說明;(6)檢測結果和cut-off值(基于檢測技術的性能或臨床建議);(7)臨床意義解讀:臨床意義解讀應客觀平實地描述,對于疾病相關性只描述既往研究中的療效或預測,不能出現使用何種治療手段或策略的語言,同時報告中應附上相關的權威指南、參考文獻、專業數據庫和分析工具網址;(8)備注:若檢測項目、方法、平臺和結果等存在局限性,建議在報告中明確指出,避免不必要的診療誤差;(9)若檢測失敗,應闡述檢測失敗的原因;(10)最終報告應由報告檢測者、制定審核者和報告簽發人聯合審定簽發。

    2

    檢測報告解讀

    液體活檢的報告解讀建議實驗室人員和臨床醫生共同完成,報告解釋應綜合考慮:(1)患者基本狀態:標本采集前的治療情況、標本采集與治療時間間隔、是否存在嚴重炎癥等;(2)疾病基本狀態:分子病理結果、腫瘤組織類型和分期、進展情況等;(3)檢測方法和平臺的特征,包括檢測敏感度和特異性以及檢測過程中的影響因素等;(4)檢測結果評判標準,如非典型腫瘤細胞和循環腫瘤微栓的判斷和報告;數字PCR檢測過程中陽性液滴的設門和空白限的設定;生物信息分析過程中對特殊標本測序數據的過濾和軟件參數的調整。

    數據分析與檢測報告注釋:

    共識18 檢測報告中除了患者與標本基本信息外,還應納入檢測體系信息與臨床意義。

    共識19 液體活檢的報告解讀建議實驗室人員和臨床醫生共同完成,報告解釋應綜合考慮多方面信息。

    展 望

    液體活檢技術正以前所未有的速度向前發展。隨著分子生物學技術的不斷革新,液體活檢檢測的靈敏度與特異性也不斷提高,使其成為未來對抗腫瘤的一大"利器"。未來液體活檢發展將集中于三個方面:(1)新臨床應用拓展,例如CTC體外培養聯合藥敏篩選個體化治療藥物、獲得的CTC進一步用于各種方法(如ARMS、FISH、NGS等)檢測腫瘤基因突變、ctDNA克隆進化分析揭示化療獲得性耐藥機制、以及液體活檢技術指導生物免疫治療;(2)新的檢測靶標發掘,外泌體、血小板以及循環非編碼RNA已經展現出巨大臨床應用潛能,有待更加深入系統的研究證實其價值;(3)新檢測技術開發與轉化應用,包括單細胞測序、質譜技術、微流控芯片及多普勒光譜等尖端技術正逐步走出基礎研究實驗室,進入臨床實驗室,依賴這些技術將切實提高液體活檢的質量。?我們應從檢驗醫學的角度出發,立足于"準確性"與"臨床有效性"這兩個關鍵點,對液體活檢項目的檢驗性能與臨床意義進行系統評估,為指導臨床精準診療提供充分的理論基礎與轉化依據。我們需要不斷總結經驗,不斷提高認識,進一步加強規范,提高檢測質量,積極推進液體活檢的發展,助力腫瘤精準診療。

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